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ECL发光实验原理
发布时间:2021-11-04 16:27:29

ECL发光实验原理

ECL 化学发光检测试剂

ECL 化学发光检测试剂是基于Luminol 的新一代增强型化学发光底物试剂,它由辣根过氧化物酶(HRP)催化发生化学反应,发出荧光,结果可以通过X光片压片和其他显影技术展现或使用Luminometer检测。溶液A主要成分为Luminol及特制发光增强剂 。溶液B主要成分为H2O2及特殊稳定剂。

ECL显色原理

发光液A和B在辣根过氧化物酶(HRP)的催化作用下,鲁米诺与过氧化氢反应生成一种过氧化物,过氧化物不稳定随即分解,形成一种能发光的电子激发中间体,当后者由激发态返回至基态,就会产生荧光。在发光过程中不需要消耗HRP,HRP只是起催化作用,所以只要HRP没降解失活,是可以重复加发光液的。但HRP作为一种蛋白酶,在室温放置时间过长,是会降解的;同时在发光过程中有什么物质(比如显影液)污染了膜的话,也有可能灭活膜上的HRP。

ECL化学发光

化学发光ECL Western Blotting,主要是依据检测体系中待测物浓度与体系的化学发光强度在一定条件下呈线性定量关系的原理,利用仪器对体系化学发光强度的检测,而确定待测物含量的一种分析方法

酶促反应的发光底物是指经酶的降解作用而发出光的一类发光底物,目前化学发光酶免疫技术中常用的酶有辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(AP)。也就是常常用来标记二抗的HRP和AP。

HRP的发光底物为鲁米诺或其衍生物和对-羟基苯乙酸(HPA)。

AP的发光底物为3-(2-螺旋金刚烷-4-甲氧基-4-甲基-4-(3-磷酸氧基)-苯基-1,2-二氧乙烷(AMPPD)和4-甲基伞形酮磷酸盐(4-MUP,荧光底物),CDP-STAR。

化学发光底物用于免疫印迹技术已有十几年的历史,目前大部分实验室做转印时都会采用化学发光技术进行检测。

应用及储存

• ELISA

• Western & Far-Western Blot

• Dot Blot

• Southern Blot

• Northern Blot

• A液和B2-8℃避光分别保存,保质期一年。

ECL操作的基本程序如下

1、进行常规电泳、转膜、HRP标记抗体或核酸探针孵育、洗膜。
2、新鲜配制发光工作液:分别取等体积溶液A和B混合,放置使之升到室温否则会减弱荧光强度。建议立即使用工作液,室温放置数小时后仍可使用,但灵敏度略有降低。
3、用镊子取出膜,搭在滤纸上沥干洗液,但勿使膜完全干燥。将膜完全浸入并与发光工作液充分接触。
4、用镊子夹起膜,搭在滤纸上沥干发光工作液。但勿洗去发光液。
5、置于发光仪中拍照。


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