实时荧光定量PCR

实时荧光定量PCR (real-time quantitative polymerase chain reaction，Real-time qPCR)，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

通常我们会重点关注Ct值（Cycle threshold ，Ct），其含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。

荧光化学

荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。其原理如下：

TaqMan荧光探针：

PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’－3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

SYBR荧光染料：

在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

荧光染料也称DNA结合染料，目前主要使用的染料分子是SYBR Green I，SYBR Green I能与DNA双链的小沟特异性的结合，游离的SYBR Green I几乎没有荧光信号，但结合双链DNA后，其荧光信号可呈数百倍的增加。随PCR产物的增加，PCR产物与染料的结合量也增大，其荧光信号强度代表双链DNA分子的数量。

不过，实验室常用的为SYBR Green I荧光染料。

SYBR Green I与双链DNA结合后会发出绿色荧光。

实时荧光定量PCR原理

扩增曲线

在Real-time qPCR中，对整个PCR反应扩增过程进行了实时的检测并记录其荧光信号，随着反应的进行，监测到的荧光信号可以绘制成一条曲线，即为扩增曲线。

荧光扩增曲线一般分为基线期、指数增长期和平台期。

在Real-time qPCR扩增早期，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，无法判断产物量的变化，此时即为基线期。

PCR反应过程中产生的DNA拷贝数是呈指数形式增加的，随着反应循环数的增加，最终PCR反应不再以指数形式生成模板，从而进入“平台期”。在该时期，扩增产物已不再呈指数级的增加，PCR的终产物量与起始模板量之间无线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出初始模板量。

只有在荧光信号的指数增长期，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可以选择在这个阶段进行定量分析。

荧光阈值

PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号。通常荧光阈值都是Real-time qPCR仪器自动设置，如无特殊情况，无需更改。

循环阈值

循环阈值 (Cycle threshold valve, Ct) 即Real-time qPCR扩增过程中扩增产物的荧光信号达到设定的荧光阈值时所经过的扩增循环次数，Ct值与荧光阈值有关。

一般Ct值位于指数增长期的开始阶段，此时样品间细小误差尚未放大且扩增效率也相对恒定，因此该Ct值具有极好的重复性，尽管平台期的DNA拷贝数波动很大，Ct值却是相对固定的。

实验设计

设计qPCR引物

产物长度在70-150bp之间；

产物GC含量在50-60%之间；

引物GC含量在40-60%之间；

应避免引物中有4个以上连续重复的碱基，推荐引物末端为G或C；

建议引物跨越一个内含子，避免扩增到基因组DNA；

通过blast，确定目标片段的特异性；

引物设计的网站

以上说了这么多引物设计的原则，实际上有一些好用的网站，基本上考虑了qPCR引物设计的各种原则。这里我推荐下面的引物设计在线网站。

https://quantprime.mpimp-golm.mpg.de/

该网站的优点：

可以通过基因ID批量设计qPCR引物，方便到可以将排名第一的引物直接导出复制粘贴到引物合成订单中，问题不大，如果不放心可以大致看一下是否符合上述的引物设计原则。

大多数物种包括拟南芥，水稻，小麦等，甚至只要在ensemble数据库有的物种基本上都可以通过ID设计引物。

大致步骤如下：

这就是最终输出的结果。

详细的使用说明可参考网站提供的手册。

需要设置空白对照NTC

目的有三：

检测引物二聚体

通常75℃的峰为引物二聚体，此时若样品孔中出现除主峰之外的75℃峰，则影响不大。

检测是否有非特异性扩增

是否存在污染

避免污染的注意事项：

使用PCR专用水；

戴手套；

专用移液器；

75%乙醇喷洗操作台，超净台最佳；

RNA质控

使用高纯度（不含DNA，蛋白质和抑制剂）和高完整度（RNA无降解）的RNA进行实验室整个RT-qPCR实验流程中最关键的环节。

需要注意的是：RNA的纯度和完整度是不相关的，需要同时严格控制。

在RNA质控的过程中，只检测RNA浓度（控制OD比值）就认为RNA可以进行后续定量是错误的认识；在测定浓度（纯度）的同时，必须经过电泳检测RNA的完整度。只有两者均严格满足要求，方可进行后续定量操作。

定量方法

测定引物扩增效率——制作标准曲线

配置具浓度梯度的标准品，利用引物进行扩增，计算每个浓度样品的平均Ct值，通过浓度梯度的log值对Ct值作图。

引物扩增效率的要求：

引物扩增效率在90-110%之间；

标准曲线R2>0.98；

Ct值的标准偏差应<0.2；

几点注意事项：

常说的Ct值=Cq值；

无论内参基因还是目的基因，Ct值推荐在15-35之间，超过35时重复性就会很差；

配置的混合mix（定量SYBR mix，水，引物等）不得二次使用；

可以PCR产物作为标准品，10μL稀释到100μL；

模板量应避免小于3μL，可计算合适浓度每个体系按5μL量加模板；

排板问题

如果需要多板布局，则每板必须设置一组相同的样品用以消除误差；

可提前排板，方便后续计算。

定量数据处理

△△Ct法计算原理及推导过程：

excel模板，用以处理qPCR数据。

黄色区域的数据粘贴在GraphPad即可出图。