Western blot实验原理

1、电泳是指带电粒子在电场作用下，向着与其电荷相反的电极移动的现象。

聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）由于无电渗作用，样品用量少（1-100μg），分辨率高，可检出10-9-10-12mol的样品，凝胶机械强度大，重复性好以及可以通过调节单体浓度或单体与交联剂的比例而得到孔径不同的凝胶。

SDS是一种阴离子表面活性剂即去污剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级及三级结构，并与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折叠结构。

2、SDS-PAGE原理

SDS-PAGE（SDS变性不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳）的分离原理根据蛋白质的分子量的差异分离蛋白质，样品处理液中通常加入溴酚蓝染料，溴酚蓝指示剂是一个较小的分子，可以自由通过凝胶孔径，所以它显示着电泳的前沿位置，当指示剂到达凝胶底部时，即可停止电泳。

分离胶从加入10%AP和TEMED起至开始出现凝胶的时间为15-20分钟（并不是此时已凝聚完全）。对浓缩胶最佳聚合速度为8-10min开始可见聚合，可以通过调节AP和TEMED的加入量来控制。一般采用恒压浓缩胶80V，分离胶120V，电泳直至溴酚染料前沿下至凝胶末端处，即停止电泳。

蛋白标准品（Molecular Weight Marker），电泳的分离效率，转膜效率以及电泳泳动情况等，皆需通过蛋白标准品来显示。

蛋白质印迹法是将蛋白质混合样品经SDS-PAGE后，分离为不同条带，其中含有能与特异性抗体（或McAb）相应的待检测的蛋白质（抗原蛋白），将PAGE胶上的蛋白条带转移到NC膜上此过程称为blotting，以利于随后的检测能够的进行，随后用牛奶将膜上的非特异性的抗原封闭，将膜与抗血清一起孵育，使第一抗体与待检的抗原决定簇结合（特异大蛋白条带），二抗与一抗结合，即检测样品的待测抗原并可对其定量。

Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。既可以定性，又可以半定量的Western是初步鉴定蛋白质最方便也是最通用的方法。

蛋白质经SDS-PAGE分离后，必须从凝胶中转移到固相支持物上，固相支持物具有牢固结合蛋白又不影响蛋白质Ag活性，而且支持物本身还有免疫反应惰性等特点，常用的支持物有：硝酸纤维膜（NC膜）或PVDF膜。

Western Blot比较不同条件下或者不同组织中，目的蛋白表达量的相对多少，前提条件是等量的蛋白上样。

3、转膜

具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小，需要的转膜时间越短。

在转膜过程中，特别是高电流快速转膜时，通常会有非常严重的发热现象，最好把转膜槽放置在冰浴中进行转膜。

转膜的效果可以观察所使用的预染蛋白质分子量标准，通常分子量最大的1-2条带较难全部转到膜上。

4、印迹膜上总蛋白的染色

在确定印迹中是否存在总蛋白之前，通过对硝酸纤维素膜或PVDF膜染色可以了解转印至膜上的总蛋白质的组成情况，并可确定蛋白质分子质量标记物的位置和确定转印成功。同时，该方法也清楚地显示出转印蛋白质的复杂性。

丽春红S印迹膜染色法：丽春红S适用于酸性水溶液，染色但是不持久，在后续的处理中红色染料易被洗去，由于与蛋白质的结合是可逆性的，该染色方法适用于所有显示抗原的饿技术，丽春红S带负电荷，可以与带正电荷的氨基酸残基结合，同时丽春红也可以与蛋白的非极性区相结合，从而形成红色条带。

5、膜的封闭

在进行抗体杂交之前，需要先对转印膜进行封闭，以防止免疫试剂的非特异性吸附。封闭一般采用异源性蛋白质或去污剂，常用的有0.2%Tween-20，20%BSA，10%马血清以及5% No-fat milk等，至于选择哪一类封闭液，首先应考虑与检测试剂相适应，如采用葡萄球蛋白A（SPA）作用检测试剂，就不能用全血清封闭，其次是尽可能使非特异着色背景浅，封闭液以20%BSA效果较好，其次是5%N-fat milk.。

6、封闭过程：

1) 洗转印膜：室温漂洗3次x10min，以尽量洗去转印膜上的SDS，防止影响后面的抗体结合。

2) 取漂洗的转印膜，放入5% No-fat milk的封闭液内，摇床震动，室温封闭2h，也可在4度过夜。

3) 用1xTBS-T ，PH7.6洗液，室温漂洗3次x10min. 

7、抗体杂交

抗体表面主要采用间接法。即先加入未标记特异性抗体（Ab1）与膜上抗原结合，再加入标记的抗抗体（Ab2）进行杂交检测，标记Ab2 物质有放射性核素，酶，以及生物素等。

8、杂交过程：

1) 封闭后的杂交膜放入杂交袋中，加入抗体稀释液稀释的Ab1浓度为1ug/ml，封口，4℃孵育过夜或室温（22-25℃）摇动孵育2h.

2) 漂洗液洗膜3次x10min

3) 标记的Ab2（羊抗兔-HRP）室温1h，洗膜3x10min

9、辣根过氧化物酶-ECL法：

发光：二抗用HRP标记，反应底物为过辣根过氧化物酶HRP-ECL发光法，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。

增强化学发光（ECL）检测是利用辣根过氧化物酶催化化学发光物质，生成一种不稳定的中间物质，其衰变时在暗室内形成明显的肉眼可见的化学发光带，利用X线胶片感光原理，将结果记录下来。