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RNA提取实验原理
发布时间:2021-11-04 15:22:25

RNA提取实验原理

通过变性剂,破碎细胞或者组织,然后通过氯仿等有机溶剂抽提RNA,再经过沉淀,洗涤,晾干,最后溶解。但是由于RNA酶无处不在,随时可能将RNA降解,所以实验中有很多地方需要注意,稍有疏忽就会前功尽弃。实验步骤破碎组织分离RNA沉淀RNA。洗涤RNA溶解RNA,保存RNA。


RNA提取实验试剂及仪器

1.试剂准备

氯仿

异丙醇

75%乙醇(in DEPC-treated water)

RNase free水或者0.5% SDS溶液 [准备不含RNase的水,将其装入不含RNase的玻璃瓶中,加入diethylpyrocarbonate (DEPC) to 0.01% (v/v)。静置过夜,然后高压灭菌。0.5% SDS溶液必须用DEPC预处理、高压灭菌的水]

2.实验步骤

1、组织匀浆

(1)  取出高温高压消毒后研钵,切取50-100mg冰冻组织置于研钵内,倒入液氮,研碎。

(2)  每50-100mg均浆组织标本中加入1ml的TRIZOL,标本的量不能超过TRIZOL体积的10%,否则会出现DNA污染。

(3)  将以上匀浆标本转移到1.5ml的EP管中,在15- 30°C放置5分钟,以彻底分离核蛋白复合体。

2、相分离

加入0.2 ml的氯仿,加盖好后用手剧烈摇晃15秒,在15- 30°C放置2-3分钟,然后离心 12,000× g,15 minutes , 2 - 8°C。离心后分成三层,下面的红色为酚-氯仿相,一个中间层,一面是无色的水相。RNA只存在于水相中。水相占总TRIZOL的60%。

3、RNA沉淀

将上层水相转移到另一干净的EP管中, 加入0.5ml异丙醇,静置10 minutes ,15 -30°C,然后离心12,000 × g ,10 minutes, 2 - 8°C。离心前可以在管的侧壁和底部看到絮状胶样沉淀,这就是RNA沉淀。

4、RNA洗涤

去上清, 加入1ml 75%乙醇洗涤RNA沉淀,振荡器混匀,离心7,500 × g ,5 minutes,2 -8°C。

5、RNA再溶解

去上清,置真空或空气中5-10分钟,干燥RNA沉淀,(不能在真空中离心干燥)。注意不能将RNA沉淀完全干燥,这样会极大地降低它的溶解度。部份溶解的RNA样品其A260/280 ratio < 1.6。

用无RNase 水或0.5% SDS溶液重悬RNA沉淀,用枪头反复吹打几次,静置10分钟,55-60°C。测浓度后-20°C保存。

6、测浓度: 取2μl 储存液加入另一个EP管中,再加入98μl无RNase水,离心混匀,以无RNase水作空白对照,测OD260/280值。1 OD=40μg RNA。OD260/280值在1.8-2.0视为纯度很高。一般浓在1000ng/ml较准。浓度太高要稀释以后再测定。

7、RNA鉴定:甲醛变性琼脂糖电泳,确定抽提RNA完整性和DNA污染情况。


注意事项:

在使用TRIZOL的时候要带手套和眼罩,避免接触到皮肤和衣服,使用化学通风橱,防止蒸汽吸入。

除非特别说明,所有的操作均在15-30°C下进行,所用的试剂均放置于15-30°C。

组织在加入氯仿之前是可以在-60—-70°C放置一个月 。RNA沉淀在75%乙醇中在2-8°C下至少可以放置一周,在–5— -20°C至少可能放置一年。