答：1. ECL发光灵敏度越高越好吗？ A: 不是。大多数实验的蛋白浓度在pg-ng级别，选用合适的发光液就可以。 2.ECL发光液为什么需要避光保存？ A:因为ECL发光液里的鲁米那等发光成分很容易因为光而失活，所以需要避光保存。 3. 目的蛋白信号弱或无。 A：在Western blot发光检测中常见的问题之一就是目的蛋白信号弱或无。首先考虑是否转膜不充分/过转，如果是，则要优化转膜条件；其次，在转膜合适的前提下考虑是否抗体-抗原敏感性过低，也可能是底物HRP或底物活性降低，可以通过加大上样量/提高抗体浓度/使用敏感底物/延长压片时间解决。曝光时间短也会使蛋白信号降低，因此，要延长胶片的曝光时间。 4. 背景较高。 A: 背景深是在Western blot发光检测中最常见的问题，造成背景深的原因很多。第一，封闭的问题，封闭条件一般为5%牛奶或BAS室温封闭2-4h，但最好4度过夜；实际上牛奶对于多数抗体来说效果不错，但二抗与牛奶可能有交叉反应，因此洗涤很重要。另外BSA蛋白单一，可降低因牛奶其他成分引起的背景。第二，TBST洗脱不彻底也会导致背景深，适当增加洗脱时间、次数、用量可以减轻背景颜色。第三，条带背景深也与曝光时间有关，曝光时间超过半小时出现背景是很正常的，所以可以的话建议曝光1-10min。英格恩公司生产的Westernblot 发光试剂EnlightTM含独特的发光增强剂和精准的发光底物，比普通发光试剂灵敏度更高、更稳定，而且发光时间长，背景更低。第四，抗原-抗体浓度/HRP过高时，直接或间接结合在膜上，洗脱不掉等原因，考虑降低抗体浓度或蛋白上样量。 5. 非特异条带 A: 非特异性条带与抗体交叉反应有关。单抗比多抗特异性好，纯度高，另外适当稀释一抗/二抗浓度，也是有必要的。如果样本在处理过程中发生降解，则样本处理时加入蛋白抑制剂在冰上操作。 6.显影后膜上条带处变为黄色或为白色。 A: 可能是HRP过高导致的敏感性或背景太高，应降低抗体浓度。 7. 条带内有无显影的白点。 A：与转膜和显影的操作有关。转膜前尽量将膜平衡，并注意胶和膜之间避免气泡。 8. 散在小圆斑 A：是牛奶封闭液中的杂质颗粒导致的，解决此类问题可提前配置好封闭液于4度保存，使用时勿混匀，仅用上层。

答：Part 1 扩增曲线异常 正常的扩增曲线一般呈S型，Ct值最好在20-30之间。异常的扩增曲线包括Ct值偏大、无平台期、平台期下降等问题。 1.Ct值偏大（如Ct值＞30） 1）模板量低或基因表达丰度低，建议增加模板量观察Ct值能否成相应倍数减少。 2）qPCR整个反应条件不适宜或引物设计不当导致扩增效率低，建议通过标准曲线确认扩增效率。 3）扩增产物过长，建议用三步法程序扩增或优化引物，扩增产物长度最好不超过300bp。 4）体系中可能存在抑制剂影响酶的活性，建议梯度稀释模板或重新制备纯度更高的模板。 2.扩增曲线无法达到平台期 基因丰度低、循环数较少，建议增加循环数或选择适合低丰度基因定量的产品。 3. 扩增曲线平台期下降 可能是基线范围设置不当，这种一般是由于模板量过高导致的。建议减小基线的终点值（一般建议设置为Ct值-4），调整后见下图。 4.扩增曲线平台期锯齿状 1）RNA纯度低，建议梯度加大模板稀释倍数看优化效果或重新制备高纯度RNA重新实验。 2）仪器长时间未校准，建议定期进行仪器校准保养。 5.扩增曲线杂乱无规律 可能是ROX浓度和机型不匹配，建议调整ROX浓度，调整后见下图。 【注】可以在仪器上将参比染料设置由ROX更改为NONE，取消ROX的校正功能，查看扩增曲线是否恢复正常，即可判定是否是ROX导致的。 6.有熔解曲线，无扩增曲线 可能是扩增程序设置错误，未进行荧光信号搜集，建议重新实验，增加扩增程序中延伸阶段荧光信号的搜集。 7.扩增曲线有向上或向下的尖峰 可能是仪器故障，建议维修仪器。 8. 阴性对照有扩增 1）NTC有扩增，可能有以下两种情况： ①Ct＞35，熔解曲线Tm值＜80℃（一般正常qPCR产物，大小在100-300bp之间，熔解曲线Tm大多在80℃以上），可能是引物二聚体导致，可进一步优化引物。 ②有Ct值且＜35，表示反应体系被污染，可逐步排除污染源。 2）NRC有扩增 NTC正常，NRC有Ct值，可能是RNA含有gDNA污染。建议用DNase I消化或使用含有gDNA去除的反转录试剂盒（如Cat NO.11141ES）。 【注】NTC是指将H2O代替模板的阴性对照反应；NRC是指将未反转录的RNA作为模板的阴性对照反应。 9.复孔重复性差 1）加样误差导致，建议移液器定期校准，另外可通过扩大反应体系或提前配制好预混液优化。 2）模板量低，建议提高模板量，使Ct值落在15-30之间。 3）仪器长时间未校准，建议定期进行仪器校准保养。 Part2 熔解曲线异常 熔解曲线常用来判断qPCR结果的特异性，理想的熔解曲线为单峰，异常的熔解曲线可能会出现双峰、杂乱等情况，下面我们来逐一分析。 1.熔解曲线出现双峰 1）双峰，杂峰Tm在80℃之前 ①可能存在引物二聚体，建议降低引物浓度或重新设计引物等方式优化。 ②可能是模板量过低，促使了引物二聚体的形成，建议提高模板量。 2）双峰，杂峰Tm在80℃之后 ①引物特异性过差导致非特异性产物扩增，建议Blast检查引物特异性或重新设计引物。 ②gDNA污染，可通过NRC进行确认。若NRC有Ct值，可重新制备模板。 2. 熔解曲线单峰但不尖锐 可能存在大小相近的非特异性产物，建议进行高分辨率琼脂糖电泳确认。 3.熔解曲线单峰但Tm值在80℃以前 推测未加模板，仅有引物二聚体的扩增。进行高分辨率琼脂糖电泳确认产物或重复实验。 4.熔解曲线峰型杂乱 1）反应体系污染，结合NTC和NRC结果确认污染情况，建议从水，引物，酶和环境等逐一排除污染。 2）试剂暴露在强光或高温下导致试剂失效，建议用新的试剂做对比实验。 3）仪器长时间未校准，建议定期进行仪器校准保养。 4）耗材与仪器不匹配，需确认对应仪器对耗材的要求。 5.有扩增曲线，无熔解曲线 可能是熔解程序设置错误，未搜集荧光信号，建议重新实验，增加熔解曲线阶段的信号搜集。 6.两种试剂平行对比，同一产物Tm值不同 可能是不同试剂的促解链成分或含量不一样，导致同一产物解链温度Tm值不一样。 7.熔解曲线前端起杂峰 可能是ROX浓度与机型不匹配，建议取消ROX校正查看熔解曲线是否正常，调整后如下图。 【注】可以在仪器上将参比染料设置由ROX更改为NONE，取消ROX的校正功能，查看熔解曲线是否恢复正常，即可判定是否是ROX导致的。

答：Western blot注意事项和常见问题： 1 我的细胞提取液有的有沉淀，有的很清亮，为什么呢？ 答：有沉淀可能因为你的蛋白没有变性完全，可以适当提高SDS 浓度，同时将样品煮沸时间延长； 也不排除你的抗原浓度过高，这时再加入适量上样缓冲液即可。 2 我做的蛋白质分子量很小（10 KD），请问怎么做WB？ 答：可以选择0.2 μm的膜，同时缩短转移时间。也可以将两张膜叠在一起，再转移。 3 最后显色时用 DAB好还是ECL好？ 答：DAB 有毒，但是比较灵敏，是HRP 最敏感的底物；ECL结果容易控制，但被催化时灵敏度差一点，但如果达到阀值，就特别灵敏，可以检测pg 级蛋白，具体可以根据你实验的情况。 4 要验证某个细胞上有无该蛋白的存在，需要做免疫组化和western blot试验吗？做这两个试验时的一抗和二抗可以共用吗？ 答：①免疫组化可以用来进行定位，但是不能精确定量，而且有时会有假阳性，不易与背景区分；Western blot可以特异性检测某个蛋白质分子，进行定 量，但是不能定位。 ②两种实验的一抗有时候不能通用，公司的产品说明一般都会说明可以进行什么实验，在免疫组化时，是否适合石蜡切片或者冰冻切片。 5 细胞水平要做western blot，多少细胞提的蛋白够做western blot？ 答：一般5×106就足够了。 6 同一样品能同时提RNA又提蛋白么？这样对western blot有无影响？ 答：能，没有问题。 7 同一蛋白样品能同时进行两种因子的Western Blot检测吗？ 答：当然可以，有的甚至可以同时测几十种样品。 8 蛋白变性后可以存放多久？ 答：－80℃，一两年没有问题。最关键两条：不要被蛋白酶水解掉；不要被细菌消化掉（也是被酶水解了）。 9 二抗是生物素化的抗体，三抗是亲和素生物素体系，不知采用这样的方案后，封闭液是否要作调整，能否再用5％的脱脂奶粉呢？ 答：不能使用脱脂奶粉，因为脱脂奶粉中含生物素，用ＢＳＡ代替应该好一点。 10 做组织样品的western的时候，怎样处理样品？ 答：必须进行研磨、匀浆、超声处理，蛋白质溶解度会更好，离心要充分，膜蛋白需用更剧烈的方法抽提，低丰度膜蛋白可能还要分步抽提(超速离心)。还有一点就是组织中的蛋白酶活性更强，需要注意抑制蛋白酶的活性。 11 免疫组化和Western Blot可以用同一种抗体吗？ 答：免疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原决定簇（又称表位），有些表位是线性的，而有的属于构象型；线性表位不受蛋白变性的影响，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；构象型表位由于受蛋白空间结构限制，煮后变性会消失。如果你所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸，也就是线性表位，那么这种抗体可同时用于免疫组化和Western，而如果抗体识别构象形表位，则只能用于免疫组化。 12 在做Western Blot时，PVDF膜用甲醇浸泡的目的？ 答：PVDF膜用甲醇泡的目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合，做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。 13 检测同一抗体的磷酸化和非磷酸化的抗原可以在同一张膜上吗？ 答：可以。 14 蛋白质的分子量跨度很大，如要分离小21KD，中至66KD，大至170KD，可以一次做好吗？ 答：这么广的分布不好转移，一般建议：21kd和66kd可以一起转，12％SDS-PAGE，湿转120mA， 45-60min就可以了， 可以根据你实验室的经验调节；170kd 用 7% SDS－PAGE，200mA 90-120min。 15 细胞裂解液选择蛋白酶抑制剂时有什么原则吗？受不受组织来源的影响？胞膜和胞浆有区别吗？ 答：一般来说提取时加入广谱的蛋白酶抑制剂就可以了，操作时保持低温。若有特殊要求可以选择相应的蛋白酶抑制剂。 16 PVDF膜和硝酸膜结合蛋白的原理是什么？ 答：一般而言，硝酸纤维素膜是通过疏水作用来和蛋白质相联，这样的话，反复洗几次后，蛋白容易掉下来，结果较差。PVDF膜主要通过它膜上的正电荷和蛋白接合，同时也有疏水作用，但相对较弱。这样的话，PVDF膜和蛋白接合较牢，不易脱落，结果较好。 17 western blot内参选择什么合适？ 答：这与目标抗原的表达位置有关，对于胞浆和全细胞蛋白，可选择内参β-actin、GAPDH和Tubulin；线粒体蛋白则可选择内参VCDA1/Porin和COXIV；核内抗原可以选择内参Lamin B1、TBP和histone。 18 不能很好地将大分子量蛋白转移到膜上，转移效率低？ 答：转移缓冲液中加入20% 甲醇（终浓度），因为甲醇可降低蛋白质洗脱效率，但可增加蛋白质和NC膜的结合能力，甲醇可以防止凝胶变形，甲醇对高分子量蛋白质可延长转移时间；转移缓冲液加入终浓度0.1%SDS，也能增加转移效率；使用戊二醛交联；降低凝胶浓度，如低至6-7%或提高转膜电压/电流，增加转移时间。 19转膜时凝胶肿胀或卷曲？ 答：可将凝胶在转膜前放到转膜缓冲液中浸泡5-10min。 20跑胶的条带歪斜或者漂移？ 答：电转仪长期使用导致海绵变薄，“三明治”结构不紧凑导致，可更换或者在两块海绵之间垫上少许普通的草纸。 21转膜后膜上有单个或多个白点？ 答：转膜时确保膜和胶块之间没有气泡。 22转膜缓冲液过热？ 答：缓冲液中离子浓度太低，电流或者电压过高，转膜过程中注意降温。 23显影后胶片背景太高？ 答：转膜前PVDF膜没有用100%甲醇完全浸湿；洗膜不充分，可以增加膜洗涤次数；封闭不完全，选择合适的封闭液和提高封闭时间；二抗浓度过高，降低二抗浓度；一抗特异性不强，换用特异性较强的单克隆抗体；曝光时间过长，减少曝光时间。 24结果没有条带或者条带很浅，杂交信号很弱？ 答：样品中不含靶蛋白或者含量太低，可增加蛋白上样量，设置已知标准量蛋白的对照；抗体稀释比例太低，孵育时间不够；转膜不好，转膜后可先用丽春红染色观看染色效果；曝光时间过短，增加曝光时间；抗体保存不当，效价降低。 25目的条带位置偏低或者偏高？ 答：胶浓度不适合，高分子量要用低浓度胶，小分子蛋白要用高浓度胶。 26有非特异性条带？ 答：目的蛋白有多个修饰位点（磷酸化位点、糖基化位点、乙酰化位点等），本身可以呈现多条带；一抗特异性不好，换用特异性较好的单克隆抗体；二抗非特异性引起的结果，可设立一组不加一抗只加二抗的平行对照来检测二抗是否有非特异性结合；样品蛋白质可能降解，提取蛋白时注意冰上操作，加入适当的蛋白酶抑制剂，避免样品反复冻融；抗体浓度过高，降低一抗和二抗的浓度。 27胶片是一片空白，是怎么回事？ 答：如果能够排除下面的几个问题那么问题多半出现在一抗和抗原制备上。 二抗的HRP 活性太强，将底物消耗光；ECM底物中H2O2，不稳定，失活；ECL底物没覆盖到相应位置；二抗失活。 28目的条带是白色，周围有背景？ 答：目的蛋白含量太高；一抗浓度偏高，二抗上HRP催化活力太强。

答：Q1细胞冷冻管解冻培养时， 是否应马上去除DMSO？ A1除少数特别注明对DMSO 敏感之细胞外， 绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞）， 在解冻之后， 应直接放入含有10-15ml新鲜培养基之培养角瓶中， 待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可， 如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。 Q2、可否使用与原先培养条件不同之培养基？ 不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基， 若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基， 细胞大都无法立即适应， 造成细胞无法存活。 Q3、冷冻管应如何解冻？ A3取出冷冻管后， 须立即放入37 °C 水槽中快速解冻， 轻摇冷冻管使其在1 分钟内全部融化， 并注意水面不可超过冷冻管盖沿， 否则易发生污染情形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时， 必须注意安全， 预防冷冻管之爆裂。 Q4、可否使用与原先培养条件不同之血清种类？ A4不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源， 所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清， 在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活。 Q5、何谓FBS, FCS, CS, HS ? A5FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思， 两者都是指胎牛血清， FCS 乃错误的使用字眼， 请不要再使用。CS (calf serum) 则是指小牛血清。HS (horseserum) 则是指马血清。 Q6、细胞冷冻培养基之成份为何？ A6动物细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含5 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 % 原来细胞生长用之新鲜培养基均匀混合之。注意：由于DMSO 稀释时会放出大量热能， 故不可将DMSO 直接加入细胞液中， 必须使用前先行配制完成。

答：Q1：96孔板操作实例外，24孔板，12孔板如何检测？ A1：与培养基1:10的比例加入。 Q2：如何测定空白孔？ A2：空白读值的来源有两部分，还原性物质与细胞本身活性。请确认以下细节。 ·还原性物质：可在正式实验之前，在培养基中加入CCK-8和待测药物。如果变色，证明药物有还原性。正式实验检测时，请在加入CCK-8前更换培养基。 ·细胞活性变化：CCK-8检测细胞活性，因此细胞活性变化，即使细胞数量不变，空白也会变化。因此需要确认细胞活性是否存在变化。 Q3：如何终止反应？ A3：有一下几种方法（96孔板）： 1、 在显色反应后，将培养板放置4℃冰箱内。 2、 每孔加10 μl 0.1 M HCL溶液。 3、 每孔加10 μl 1%（w/v）的SDS（十二烷基硫酸钠）溶液。 注意：反应停止后，应在24小时之内测定。 4、使用本公司Stop Solution for CCK-8(货号:CK13). Q4：我可以使用450 nm以外的滤光片吗？ A4：可使用430-490nm的滤光片，450nm滤光片最优。WST-8甲臜染料吸收光谱： Q5：CCK-8运输与保存条件？ A5：试剂在4℃下可稳定保存24个月。如需长期存放可保存-20℃，但不要反复冻融。如更换其他容器，请先进行稳定性实验，确认试剂稳定性。 Q6：一个孔中应接种多少个细胞？ A6：当使用标准96孔板时，贴壁细胞的最小接种量至少为1,000 个/孔 (100 μl 培养基)。检测白细胞时的灵敏度相对较低，因此推荐接种量不低于2,500 个/孔 (100 μl 培养基)。如果要使用24孔板或6孔板实验，请先计算每孔相应的接种量，并按照每孔培养基总体积的10%加入CCK-8溶液。 Q7：能否用384孔板进行试验？ A7：可以。向各孔中加入培养基体积10%的CCK-8溶液，如果加入的CCK-8体积太少，可以先将CCK-8溶液稀释1倍，然后加入培养基体积20%的量 Q8：能否用24孔板进行试验？ A8：可以。向各孔中加入培养基体积10%的CCK-8溶液。 Q9：酚红会影响检测吗？ A9：不会。培养基中酚红的吸光度可以在计算时，通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不会对检测造成影响。 Q10：CCK-8与胸苷结合检测之间是否有相关性？ A10：有。然而，请注意由于CCK-8使用的检测原理与胸苷检测的不同，因此结果可能不同。 Q11：CCK-8能否检测细菌细胞？ A11：可以检测E.coli，但不能检测酵母细胞。向100 μl E.coli培养液中加入10 μl CCK-8溶液，并培养1-4个小时或过夜。但是更推荐使用我公司货号M439的：细菌活性检测试剂盒。 Q12：如何减少由于CCK-8试剂在枪头上或孔壁上的残留所带来的误差？ A12：可以在加样前用培养基稀释CCK-8试剂并混匀后加样。 Q13：CCK-8是什么颜色？ A13：应该是粉红色。若颜色不一样，有可能会影响测定。 Q14：CCK-8能否对活细胞进行染色？ A14：不能。因为CCK-8的主要成分是一种水溶性的四唑盐 (WST®-8)，并通过电子载体1-Methoxy PMS将活细胞中的电子交换到培养基中的WST®-8上。由于生成的甲臜也是高度水溶性的，因此CCK-8不能对细胞进行染色。 Q15：CCK-8检测溶液对细胞是否有毒？ A15：CCK-8溶液自身因为高浓度的1-Methoxy PMS的存在而具有一点毒性。但是，加到培养基中的CCK-8是没有毒性的，因为被稀释了10倍。因此，长时间的培养，如过夜或者培养数天是可以的。同一个细胞培养液在CCK-8检测后还可以用于其他细胞增殖检测，如结晶紫检测，中性红检测或者DNA荧光检测等。由于每种细胞对于CCK-8的耐受力都不同，因此在需要进行长时间培养时，先检测一下细胞在加入CCK-8培养后的活力。 Q16：在做加药实验时，药物对测定是否有影响？如何解决？ A16：有时会有影响。如果药物具有还原性，会和CCK-8发生显色反应，增加吸光度。解决办法：首先要确认药物是否有吸收，在含有药物的培养基中加入CCK-8，测定450 nm的吸光度，如果它的吸光度比不含药物的培养基 (加CCK-8)的吸光度高，则证明药物有影响，可在加CCK-8之前更换培养基，去掉药物的影响。 Q17：每次测定的数值不一样，是什么原因？如何解决？ A17：可能会有以下几个原因： 1. 当在培养箱内培养时，培养板最外一圈的孔最容易干燥挥发，由于体积不准确而增加误差。 一般情况下，最外一圈的孔只加培养基，不作为测定孔用。 2. 有可能会因为CCK8沾在壁上而产生误差，建议在加入CCK-8后，轻轻敲击培养板以帮助混匀。 3. 每孔的细胞数量过多或过少。请预先在1,000-100,000个/孔范围内摸索条件。 Q18：如何设定空白对照？ A18：在不含细胞的培养基中加入CCK-8，培养一定的时间，测定450 nm的吸光度即为空白对照。在做加药实验(细胞毒性实验)时，还应考虑药物的吸收，可在不含细胞，加入药物的培养基中加入CCK-8，培养一定的时间，测定450 nm的吸光度作为空白对照。 Q19：哪些物质会影响CCK-8的测定？ A19：当有还原性物质存在时会影响CCK-8的测定，例如含有维生素C的Glucose等 (一般培养基中的量不多，酚红或血清不影响测定)。在有酚红存在的情况下，会增加空白吸收，但不影响测定，扣除空白吸收即可。 Q20：在实验中吸光度值太高，如果不能减少细胞数量，如何解决？ A20：可以缩短加入CCK-8后的培养时间。例如：可以把加入CCK-8试剂后的培养时间由2小时缩短为1小时。 Q21：设定参比波长的目的是什么？必须设定吗？ A21：不一定要设定。CCK-8试剂在参比波长没有吸光度。设定参比波长的目的是为了取出由于样品混浊所带来的吸收。 Q22：说明书上仅写了96孔板的测定方法，如果使用24孔板货12孔板，应该加多少量的CCK-8试剂？ A22：一般情况下建议加入CCK-8试剂的量是培养基体积的1/10。 Q23：必须预培养细胞吗？ A23：不一定。如果要向保持细胞的最好状态，建议预培养细胞。如果不做细胞预培养，细胞内的脱氢酶可能会不稳定。也有人不做细胞预培养，但在做标准曲线和检测时需要统一检测条件。 Q24：如果加入的药物中含有金属，是否会有影响？ A24：金属对CCK-8显色有影响。当终浓度为1 Mm的氯化亚铅、氯化铁、硫酸铜会抑制5%、15%、90%的显色反应，使灵敏度降级。如果终浓度是10 Mm的话，将会100%抑制。 Q25：预培养后，更换培养基需要细胞计数吗？ A25：一般情况下用胰蛋白酶处理对数增长期的细胞，用血球计数盘计数，制备成一定浓度的细胞悬液即可。如果想要精密计数细胞的话，可以预培养后取培养基用血球计数盘进行计数。 Q26：CCK-8对于不同的细胞，灵敏度是否一样？ A26：不一样，悬浮细胞与贴壁细胞相比较难染色。对于贴壁细胞，一般加入CCK-8培养1-4小时吸光度已经很高，但对于悬浮细胞则可能吸光度较低，可以通过延长CCK-8的加入时间或增加细胞数量来解决。 Q27：悬浮细胞和贴壁细胞在数量上有何区别？ A27：悬浮细胞由于显色比较困难，一般需要增加细胞数量和延长培养时间。贴壁细胞显色比较容易，若细胞数量过大，有时吸光度会超过酶标仪的读数。 Q28：应该每次做标准曲线吗？ A28：建议每次做。虽然细胞是一样的，但是细胞的状态不一定一样，对于状态不一样的细胞，建议每次做标准曲线。如果试剂的批号不一样，灵敏度可能会有轻微的差异，对于不同的批号建议分别做标准曲线。 Q29：有时在药物作用情况下，细胞已经死亡，但是脱氢酶的活性还在，是否能计算细胞数量？ A29：不能。由于CCK-8是通过和细胞内的脱氢酶进行反应间接反映活细胞数量

答：Q1：RNA提取得率低。 A1：(1) 样本保存不当或者样本保存时间过久。样本保存不当或者保存时间过长都有可能导致RNA的降解，采集新鲜样本或经过液氮速冻后保存于-70℃或液氮中的样本。 (2) 匀浆或者液氮研磨不充分。匀浆或者液氮研磨不充分，裂解不充分，导致RNA的释放不充分。 (3) 组织或者细胞中RNA含量偏低：不同细胞和组织中 RNA 的丰度不同，需做预实验确定合适的样品起始量。 (4) 组织起始量太少或者太多：样品量过少，则细胞组织中RNA含量较低；样品量过多则可能超过裂解液的裂解能力，裂解将不完全，从而导致RNA得率低或质量下降。 (5) 洗脱不充分。RNase-free ddH2O滴加到纯化柱膜中央。纯化柱的洗脱体积为50-200 μl，若洗脱效果不理想，可以加入在65℃预热的RNase-free ddH2O后，延长室温放置时间，离心后进行第二次洗脱。 Q2：gDNA-Filter Columns堵塞问题。 A2：(1) 样品用量太多。本试剂盒适用于提取10-20 mg动物组织或者2-5×106个细胞，超量的组织会降低产量以及纯度，操作时应减少样本使用量。 (2) 样品富含肌纤维。肌肉、心脏以及皮肤等富含肌纤维，肌纤维的分子量大，会引起柱子堵塞，样本处理时采用液氮研磨方式会降低堵柱现象。 (3) 组织研磨或者匀浆不充分。研磨或者匀浆不充分时，碎片有可能导致柱堵塞，将裂解后的液体先进行 13,000×g 离心5 min，取上清再加入gDNA-Filter Columns。 Q3：RNA降解。 A3：纯化后的RNA降解与样本质量、是否被RNase污染、操作方式等因素有关： (1) 样本因为没有及时保存，导致RNA降解。组织样本或者细胞在收集后若不及时进行后续实验，液氮速冻后于-80℃保存。 (2) 样本反复冻融。组织样本保存时，分小块保存，避免因反复冻融导致样本降解。 (3) 电泳原因。常见的RNA降解现象部分因为电泳过程引起的，电泳前将电泳槽用3％双氧水浸泡20 min，之后用RNase-free ddH2O进行冲洗，电泳缓冲液用RNase-free ddH2O配置。 (4) 确保提取过程中使用的枪头和离心管均为RNase-free。 Q4：提取的RNA有基因组DNA污染。 A4：不同种类组织细胞DNA、RNA含量相差很大，请勿超过20 mg组织和5×106细胞。如肝脏、脾脏和肾脏DNA含量丰富，请勿超过10 mg，否则会导致基因组残留过多。gDNA-Filter Columns能够有效去除体系中大部分DNA，如果下游实验对微量DNA十分敏感，可根据具体情况选择选择使用以下方案： (1) 使用试剂盒提供的DNase I进行膜上消化清除DNA污染。 (2) 设计引物时选用跨内含子的引物，从而避免基因组DNA模板参与扩增反应。 (3) 逆转录时选择含有基因组去除模块的逆转录试剂。